Programa analítico del curso

Determinación de la Estructura Cristalográfica de Proteínas: Estado del Arte en Argentina

Clases teóricas

Tema 1: Introducción histórica a la cristalografía. Los cristales como entidad repetitiva. Descubrimiento de los rayos X y del fenómeno de difracción. Orden en materiales y propiedades. Experiencia de Laue. Definición clásica y actual de cristal. Resolución de la estructura del cloruro de sodio. Monocristales y policristales. Materiales amorfos. Hitos de la cristalografía. Limitaciones. Cristalografía en Argentina y en la región. La Unión Internacional de Cristalografía.

Tema 2: Equipamiento en cristalografía. Generación, colimado y monocromatización de rayos X. Difractómetros de monocristal. Sincrotrones. Líneas de cristalografía. Detectores. Sistemas de enfriamiento de cristales y de depósito y recuperación automáticos de muestras.

Tema 3: Estructura y función de proteínas. Expresión y diseño de construcciones proteicas para cristalización. Bases de datos para la obtención de la región de ADN que codifica la proteína de interés. Programas de predicción de solubilidad y cristalización. Mejoramiento de construcciones. Consideraciones a tener en cuenta para la elección del sistema de expresión y purificación procariota o eucariota. Purificación por cromatografía. Ejemplos prácticos.

Tema 4: Base de datos del PDB. Estadísticas y búsquedas. Representación de estructuras y mapas de densidad electrónica para publicación. Programas más utilizados. Métodos de cristalización de proteínas. Microdiálisis. Batch. Difusión de vapor en gota colgante o sentada. Ventajas y desventajas de cada caso. Composición de las soluciones de cristalización. Kits comerciales. Cribado robótico. Visualización automática de gotas de cristalización. Optimización del crecimiento cristalino. Micro y macroseeding. Preparación de las muestras cristalinas para su medición. Capilares. Loops. Dewars. Pucks. Crio-cristalografía.

Tema 5: Estrategias de medición. Método de rotación. Helical scanning. Algoritmos para el centrado de muestras. Fine-slicing y recomposición tridimensional de spots de difracción. Goniómetros kappa. Ventaja de fuentes microfoco. Indexación, integración y escalado de datos de difracción.

Tema 6 : Simetría cristalina. Conceptos de celda unitaria, sistema cristalino y unidad asimétrica. Elementos de simetría. Interferencia y difracción de rayos X por dos electrones. Extensión del fenómeno a átomos, moléculas, celdas unitarias y cristales. Concepto de red directa y recíproca. Factor de forma atómico y factor de estructura. Descripción vectorial y compleja. El problema de las fases. Condiciones de Laue e Indices de Miller. Transformada de Fourier. El problema de las fases. Métodos de resolución: reemplazo isomorfo, dispersión anómala y reemplazo molecular. Función de Patterson. Ley de Friedel. Mapas de densidad electrónica. Modelado y refinamiento estructural. Búsqueda, reconocimiento y corrección de errores. Validación. Depósito de las estructuras en el Protein Data Bank. Análisis estructural.

Trabajos Prácticos de Laboratorio y Clases de Resolución de Problemas

Estarán a cargo del Director del Curso y de los Profesores colaboradores.

Práctico 1. Trabajo práctico de cristalización de lisozima de clara de huevo de gallina por los métodos de difusión de vapor en gota sentada y microseeding. Visualización y manipulación de los cristales obtenidos.

Práctico 2. Trabajo práctico computacional de resolución de la estructura de lisozima de clara de huevo de gallina por reemplazo molecular (primera parte): Visualización de imágenes de difracción y sus spots. Indexación. Integración. Conceptos de completitud, señal sobre ruido, redundancia, coeficiente de correlación, spots totales y únicos. Obtención de un archivo MTZ final con módulos de factores de estructura.

Práctico 3. Trabajo práctico computacional de resolución de la estructura de lisozima de clara de huevo de gallina por reemplazo molecular (segunda parte): Reemplazo molecular. Armado del modelo de búsqueda. Empaquetamiento cristalino. Primer ciclo de refinamiento. Visualización del modelo y sus mapas. Modelado del extremo C-terminal de la proteína. Disminución de los factores R y Rfree.